Microbiota endometriale e infertilità: quali credenze e quali evidenze?

Esiste una costante e progressiva spinta della comunità medica negli ultimi anni a valutare il microbiota endometriale – un tempo ritenuto assente – perché probabile determinante del momento cruciale dell’inizio dello sviluppo dell’uomo nell’utero materno: l’impianto embrionale [1-13]. Grazie ai progressi nella tecnologia con il sequenziamento, la letteratura ha portato alla considerazione scientifica il ruolo dei batteri commensali (il microbiota) nella fisiologia. Nella relazione mutualistica tra le comunità microbiche e l’ospite umano, l’ospite fornisce i nutrienti per sostenere la crescita batterica, mentre le comunità microbiche forniscono difesa contro i patogeni, modellano lo sviluppo e la maturazione del sistema immunitario, aiutano a digerire cibo e fibre, producono vitamine, metabolizzano gli xenobiotici [14]. Il termine microbiota si riferisce a tutti i microrganismi in un ambiente, inclusi batteri ed eucarioti unicellulari (e talvolta virus), e il termine microbioma si riferisce invece alla raccolta di genomi del microbiota.

Le cellule batteriche nel corpo umano rappresentano tra l’1% e il 3% del peso corporeo totale e sono almeno pari in numero alle cellule che compongono il corpo umano [15]. Recenti ricerche si sono concentrate sulla comprensione di come le diverse popolazioni batteriche nel corpo (ad es., microbiomi intestinali, respiratori, cutanei e vaginali) predispongano alla salute e alla malattia. Il microbiota dell’apparato riproduttivo è di derivazione dalle popolazioni batteriche vaginali. Va tuttavia qui ricordato che, mentre il microbiota vaginale è stato studiato a fondo, il microbiota endometriale e il suo possibile ruolo sulla funzione riproduttiva rappresentano ancora un terreno culturalmente inesplorato [14].

La comunità scientifica tutta si è prodotta e si sta producendo nella direzione di caratterizzare questo microbiota nell’ambiziosa finalità di caratterizzarne fisiologia e patologie. Con molte suggestioni ma poche evidenze. Che con questo breve articolo vogliamo evidenziare, separando le evidenze dagli studi suggestivi ma privi di evidenza.

Esiste infatti il problema di natura etica e deontologica della prescrizione di esami o procedure volte a migliorare l’impianto embrionale ancora sperimentali e non suffragate da evidenze ma svolte imputando costi economici alle coppie. Sono queste ultime esaustivamente informate dello stato dell’arte della ricerca su questo tema?

Uno studio di Koichi Kyono et al del 2017 che mirava ad analizzare gli esiti della gravidanza dei pazienti con fecondazione in vitro ha messo a confronto pazienti con microbiota dominato da Lactobacillus (LDM) o non dominato da Lactobacillus microbiota (NLDM) del loro endometrio. Ha quindi evidenziato che i casi che erano trattati per NLDM con antibiotici e integratori prebiotici/probiotici nel novero di una popolazione (99 pazienti) infertile giapponese. Lo studio rivelò che i tassi di gravidanza nei casi di trasferimenti di una sola blastocisti erano più alti nel gruppo LDM (58,9% per paziente e 36,3% per FBT) rispetto al gruppo NLDM (47,2% per paziente e 34,7% per “frozen‐thawed blastocyst transfer”, FBT) ma non significativamente diversi. I risultati di questo studio non dimostravano nulla ma davano una ancorché flebile indicazione di vantaggio di un endometrio popolato da Lactobacillus in riferimento all’esito della gravidanza. Da qui il recupero di un endometrio trattato nella finalità di popolarlo con Lactobacillus potrebbe avere beneficio nel migliorare le percentuali di impianto [1]. La utilizzazione del condizionale è d’obbligo perché – scriviamolo subito – le evidenze non ci sono e quelle che ci sono ad oggi restano piuttosto deboli.

Attualmente, vengono riferiti cinque microbiomi distinti in base alla sede corporea: cavità orale, cavità nasale, pelle, tratto genito-urinario e tratto gastrointestinale [14]. All’interno di queste distinte sedi anatomiche ci sono ulteriori habitat microbici, come la lingua, la guancia e il labbro della cavità orale [14]. Mentre il microbiota intestinale ha di gran lunga la comunità microbica più densa e diversificata, nel tratto riproduttivo inferiore un microbiota sano è dominato dalle specie Lactobacillus. I lattobacilli sono batteri che producono acido lattico e proteggono la vagina mantenendo un pH basso che è impeditivo per la crescita della maggior parte dei batteri. Anche il tratto riproduttivo superiore, a lungo considerato sterile, possiede un proprio microbiota specifico, da 100 a 1000 volte meno denso [14], ma dominato da una maggiore varietà di specie batteriche e anche da ceppi di Lactobacillus diversi rispetto al microbiota vaginale sano [14].

Sembra tuttavia ormai stabilito che il tratto riproduttivo femminile contenga un microbioma attivo inclusivo di batteri del genere Lactobacillus, che è associato a uno stato di buona salute del microbioma. Che può tuttavia avere fluttuazioni spazio-temporali in risposta a fattori interni ed esterni. Queste fluttuazioni possono avere un impatto sulla fisiologia dell’utero stesso e portare anche a condizioni patologiche.

Il microbioma endometriale può avere un impatto sull’infertilità e nell’esito dell’impiego delle tecniche di riproduzione assistita? Gli autori di un lavoro relativamente recente concludono che la valutazione del microbioma del tratto riproduttivo aggiunge una nuova prospettiva per la riproduzione umana, per la gravidanza e l’inizio di una nuova vita, sottolineando l’importanza di considerare la valutazione delle colonie microbiche per migliorare l’assistenza personalizzata nella medicina riproduttiva e nella salute delle donne [2]. Tuttavia ancorché suffragata da molte osservazioni non esiste evidenza forte circa la relazione causale tra microbiota e impianto embrionale e prosieguo della gravidanza. Ma la ricerca sta continuando e risultati tangibili potrebbero essere prodotti essenziali per una migliore diagnosi e cura in un futuro non lontano.

Il tratto riproduttivo femminile ospita comunità microbiche distinte, come nella vagina, canale cervicale, utero e tube di Falloppio. La natura del microbiota vaginale è ben nota; al contrario, il tratto riproduttivo superiore rimane in gran parte inesplorato. Alterazioni del microbiota uterino dipendono dai nutrienti e dagli ormoni disponibili in utero. È possibile – qualcuno lo ha ipotizzato – che da questo dipendano alcune malattie proprie di questo organo come i miomi, l’adenomiosi, e l’endometriosi. Anche qui senza alcuna prova. La mucosa uterina costituisce una importante barriera tissutale la cui funzione principale è quella di offrire protezione contro agenti patogeni e altri fattori tossici, mantenendo una relazione simbiotica con i microbi commensali. Queste caratteristiche sono condivise da tutte le mucose; quella uterina è tuttavia unica per la sua caducità ciclica e la sua modificazione permanente, anche in corso di gravidanza. Il sistema immunitario, oltre al suo ruolo nel processo di difesa, svolge ruoli cruciali nella riproduzione in quanto assicura la tolleranza immunitaria locale agli antigeni fetali/paterni, una resistenza modulare all’invasione trofoblastica e al rimodellamento vascolare. L’endometrio umano contiene un cospicuo numero di cellule immunitarie, principalmente cellule natural killer (NK), che sono fenotipicamente distinte dalle NK citotossiche periferiche, cellule e macrofagi. Anche l’endometrio contiene pochi aggregati linfoidi comprendenti cellule B e cellule T CD8+. Il numero e il fenotipo di queste cellule cambia durante il ciclo mestruale. È diventato evidente negli ultimi anni che il fenotipo e la funzione delle cellule immunitarie possono essere influenzati dal microbiota. Le cellule immunitarie possono percepire la presenza di microbi attraverso i loro recettori di riconoscimento, stabilendo l’interazione ospite-microbo. Il microbiota esercita un’azione di difesa controllato dalla competizione per i nutrienti con gli agenti patogeni. C’è stato un aumento interesse a caratterizzare la natura della colonizzazione microbica all’interno dell’utero e il suo apparente impatto sulla fertilità e sulla gravidanza [3].

La fertilità dipende dall’interazione dell’embrione con l’endometrio preparato dagli ormoni steroidei allo stadio di blastocisti (5/6 giornata di sviluppo), sulla cui qualità/capacità di sviluppo sono state fatte molte ricerche con risultati importanti così come sullo stato ricettivo dell’endometrio, influenzato – come sappiamo – da modificazioni ormonali (endocrine, paracrine e autocrine) e strutturali, nonché dal sistema immunitario [4]. L’immunità locale e quella sistemica sono fortemente influenzate dal microbiota. La scoperta della presenza di 16S rRNA nell’endometrio e la capacità di rilevare un microbiota a bassa biomassa ha suffragato l’idea che l’utero possa essere davvero un compartimento non sterile. Il concetto di “utero sterile”, ormai datato, si scontra con gli effetti in utero del microbiota sulla prole e sulla loro immunità neonatale. Più recentemente è maturata la consapevolezza dell’importanza del microbiota uterino per la fisiologia dell’endometrio nella salute riproduttiva.

La colonizzazione commensale dell’utero è stata ampiamente discussa in letteratura con un possibile ruolo del microbiota uterino per l’immunità dell’ospite e l’adattamento dei tessuti. Sulla base della conoscenza dell’interazione delle cellule immunitarie della mucosa dell’intestino con il microbioma locale, si sono prodotte le potenziali implicazioni della colonizzazione commensale per la salute delle funzioni uterine.

La presenza di microbiota o le loro molecole costituenti, come il polisaccaride A della capsula Bacteroides fragilis, si accompagna a una sana funzione fisiologica. Anche le terapie batteriche, comunemente note come probiotici, sono sempre più oggetto di ricerca, una conseguenza naturale della nostra crescente conoscenza del microbioma. I probiotici mirati possono ricostituire il microbiota impoverito per varie e diverse cause, ripristinare condizioni di salute e di conseguenza aiutare a curare infezioni e malattie [14].

Le lezioni apprese dal microbioma intestinale suggeriscono che il microbiota dell’utero può potenzialmente modulare sottoinsiemi di cellule immunitarie necessari per l’impianto e hanno implicazioni anche per la morfologia dei tessuti. Anche il microbiota può essere cruciale nella protezione contro le infezioni uterine difendendo la propria nicchia e competendo con i patogeni. Si evidenzia la necessità di studi ben strutturati su uno status microbico “di base” dell’utero che rappresenti il punto di partenza ottimale per l’impianto e la successiva formazione di placenta. La complessa interazione di processi e cellule coinvolte in una gravidanza sana è ancora poco conosciuta. Un corretto status per un endometriale ricettivo, compreso l’ambiente immunitario locale, è fondamentale non solo per la fertilità ma anche per la formazione della placenta poiché l’inizio della placentazione dipende fortemente dall’interazione con le cellule immunitarie. Fallimento dell’impianto, aborto ricorrente e le patologie dell’endometrio e della placenta, come la pre-eclampsia, rappresentano un onere sociale crescente. Sono necessari studi più strutturati per indagare la colonizzazione uterina [5].

1. Varie review recenti si sono focalizzate sulla colonizzazione endometriale batterica e la fertilità femminile [6-9].
2. Da più parti viene messa in correlazione la presenza di specifici microbiota con la corretta predecidualizzazione per l’impianto embrionale. Cioè con le modificazioni chimico-morfologiche utili all’impianto [5].

Quali evidenze?

A) Un gruppo di 37 esperti di fertilità, inclusi medici di tutta Europa, si è riunito per generare raccomandazioni sulle migliori pratiche cliniche [14]. Sono stati formati piccoli gruppi per la discussione iniziale di quattro argomenti chiave:

1. valutazione clinica: come viene valutato l’ecosistema microbico riproduttivo nelle donne? Quali strumenti vengono utilizzati e in quali pazienti?
2. endometrio e impianto: qual è il ruolo del microbioma endometriale nella ricettività endometriale, nell’impianto e nel fallimento ricorrente dell’impianto?
3. infertilità: come dovremmo valutare e trattare i pazienti infertili e i pazienti con vaginosi batterica utilizzando il microbioma?
4. nascita: quali tecniche possono essere utilizzate per valutare le strutture microbiche e valutare il rischio di parto pretermine e aborto nelle donne in gravidanza?

Secondo le nostre attuali conoscenze, nelle donne sane non gravide il microbioma vaginale è dominato da quattro specie di Lactobacillus: L. crispatus, L. iners, L. jensenii o L. gasseri [14]. La composizione del microbiota vaginale mostra grandi differenze etniche e varia nel corso della vita della donna a seconda di eventi fisiologici, come il ciclo mestruale e la gravidanza, e di fattori esterni, come l’attività sessuale, le abitudini igieniche e i trattamenti medici. La vaginosi batterica è un esempio di uno stato alterato del microbioma vaginale, caratterizzato da deplezione di Lactobacillus e aumentata presenza di batteri anaerobi. La vaginosi batterica colpisce il 20-50% delle donne in età riproduttiva e rappresenta un fattore di rischio di subfertilità e infertilità [13,14]. L’aumento della presenza di batteri specifici (Atopobium vaginae, Ureaplasma vaginae, U. parvum, U. urealyticum e Gardnerella), normalmente osservata nelle vaginosi batteriche asintomatiche, insieme a una maggiore abbondanza di Candida e a una riduzione del Lactobacillus vaginale e cervicale, è spesso presente nelle donne con problemi di sterilità [13,14]. Inoltre, la disbiosi vaginale riduce le difese locali contro i patogeni sessualmente trasmissibili e l’ascesa dei patogeni lungo le tube di Falloppio può influenzare com’è noto la salute riproduttiva. Un microbiota ricco di Lactobacillus spp. senza vaginosi batterica, clinica o subclinica, porta a esiti più positivi con impiego di Tecniche di Fecondazione Assistita (ART) [13,14].

Dopo la scoperta di un microbioma endometriale specifico e indipendente [13-15], diversi studi si sono concentrati sulla disbiosi endometriale [13-15]. La disbiosi endometriale può essere la causa del fallimento dell’impianto e portare all’infertilità [15].

B) Un endometrio con la presenza dominante di Lactobacillus pare essere più ricettivo di un endometrio con un’elevata diversità batterica e una bassa percentuale di lattobacilli [8,14]. Le fluttuazioni ormonali, specialmente negli estrogeni, sono implicate nella regolazione del microbiota vaginale e nella preparazione dell’endometrio per l’impianto [15]. Il microbiota endometriale non cambia sotto l’influenza ormonale nel periodo precedente l’impianto. Secondo alcuni autori [14,15] dovremmo iniziare a considerare il microbiota endometriale e il suo stato di salute prima di iniziare la fecondazione in vitro, al fine di massimizzare la possibilità di risultati positivi. Ma su questo punto le evidenze sono molto, molto, molto scarse.

Sulla base di una revisione sistematica, l’American Society for Reproductive Medicine (2017) sconsiglia vivamente l’uso di antibiotici prima del trasferimento dell’embrione. È in corso uno studio clinico randomizzato su pazienti con fecondazione in vitro presso la Washington University per valutare il tasso di gravidanza clinica quando si sospende la terapia antibiotica profilattica di routine durante la fecondazione in vitro (NCT03386227).

Una comprensione più completa del ruolo del microbioma riproduttivo aprirebbe nuovi spiragli a trattamenti migliorativi per la fertilità e una comprensione più sfumata della salute riproduttiva nel suo insieme. I risultati del gruppo di C Simon dimostrano l’esistenza di un microbiota endometriale altamente stabile durante l’acquisizione della recettività endometriale. Tuttavia, la modificazione patologica del suo profilo è associata a scarsi risultati dei programmi di fecondazione in vitro [14,15].

Come noto il panel di consenso coordinato da Velasco et al introduce [14], sull’argomento, una evidenza di grado 4 che vive quando mancano evidenze di grado superiore.

Sulla base degli attuali studi pubblicati, nessuna informazione sui batteri e la distribuzione di un “microbioma uterino centrale” può essere dimostrato. Non si è ancora giunti a definire senza rischio di contaminazioni, quale sia la colonizzazione basale di un utero indipendentemente dalle sue possibili patologie. Anche gli studi prospettici devono affrontare la questione se il 16S rilevato derivai da frammenti batterici piuttosto che da organismi vivi utilizzando un approccio più solido rispetto alla coltura in vitro poiché (pur dimostrando che la coltura non è impossibile) spesso la crescita non può essere stabilita nei casi di questi campioni a biomassa ultra bassa. Sono certamente necessari studi di coorte di grandi dimensioni ben impostati per definire un microbioma uterino sano. Voglio sottolineare anche che sebbene non sia ancora possibile stabilire un profilo batterico tipico dell’utero, i dati esistenti non sono da sottovalutare come prova verso una naturale presenza microbica all’interno dell’utero. Alcuni degli studi fin qui svolti hanno considerato controlli negativi e/o tamponi vaginali aggiuntivi. Purtroppo la numerosità delle specie batteriche di questi controlli non era identica ai risultati da materiale endometriale, e quindi si dovrebbe riconsiderare il quadro anche alla luce di un microbiota locale [5].

Per capire come il microbiota potrebbe svolgere un ruolo nell’interazione uterina di cellule coinvolte nel periodo dell’impianto, dobbiamo prima capire come l’endometrio costituisca la base per il successo dell’impianto embrionale e della placentazione.

Ogni mese, prima della comparsa in cavità uterina di un embrione in via di sviluppo, l’endometrio dispone una composizione cellulare utile alla invasione del trofoblasto (la futura placenta). Durante la fase luteale media-tardiva si verifica la decidualizzazione spontanea del tessuto endometriale che riguarda la importante modificazione morfologica delle cellule stromali che diventano deciduali, le cellule epiteliali che si arricchiscono di glicogeno e modificano la loro presenza nucleare e i vasi che prima proliferano e poi modificano la loro configurazione; cioè la trasformazione dell’endometrio in uno stato ricettivo, indipendente dalla presenza o meno della blastocisti in utero. E 6-10 giorni dopo l’ovulazione (durante i giorni 19-24 del ciclo mestruale) lo stato ricettivo dell’endometrio è modellato. Questo è indicato come “la finestra di impianto” (WOI), della durata di 2-4 giorni [10,11]. I sostanziali adattamenti fisiologici necessari per i cambiamenti ciclici corretti dell’endometrio sono orchestrati dalle fluttuazioni di estrogeni e progesterone, nonché dalle cellule immunitarie e dai loro prodotti stromali endometriali: i fibroblasti, ad esempio, si differenziano per diventare più grandi, arrotondati. Per raggiungere questo obiettivo, il citoscheletro e la membrana plasmatica subiscono modifiche. L’epitelio luminale deve essere in grado di interagire con la blastocisti. Le interazioni coinvolgono anche molecole di adesione, come integrine, ligandi di L-selectina (ad es., ligandi di L-selectina espressi dall’epitelio luminale e recettori L-selectina della blastocisti) e oligosaccaridi.

L’esame sulla natura della colonizzazione mediante il sequenziamento e la coltivazione del gene 16S rRNA ha portato a definire popolazioni microbiche distinte nel canale cervicale, nell’utero, nelle tube di Falloppio e nel peritoneale fluido, diverse da quelle della vagina.

Esiste un continuum del microbiota lungo il tratto riproduttivo femminile, indicativo di un ambiente non sterile. Sono state individuate anche popolazioni microbiche potenzialmente correlate al ciclo mestruale e popolazioni sovrarappresentate in soggetti con adenomiosi o infertilità da endometriosi aprendo nuovi capitoli di studio [12].

Gli elementi chiave nell’interazione blastocisti-endometrio necessari per un endometrio ricettivo sono rappresentati da una corretta interazione tra il trofoblasto invasore e l’immunità locale al fine di ottenere un corretto sviluppo dei villi e una placenta sana. Tutte queste proprietà regolate dell’endometrio e necessarie nella fase iniziale della gravidanza sono forse anche influenzate dal microbiota uterino.

Il microbiota uterino può contribuire alla fisiologia dell’endometrio sano. Dopo la stimolazione del recettore di riconoscimento, le cellule epiteliali rilasciano fattori solubili, come le citochine, che colpiscono le popolazioni di linfociti locali. Se i batteri sono naturalmente presenti nell’utero, si può immaginare un’interazione simile con le cellule ospiti come si vede nella mucosa dell’intestino.

Consigli pratici

Allo stato attuale delle conoscenze pur riconoscendo che il microbiota rappresenti un interessante tema di studio da approfondire con una migliore caratterizzazione delle popolazioni di batteri di un endometrio sano differenziandolo da quelli patologici non esistono indicazioni di evidenza per trattamenti utili nel miglioramento dell’impianto embrionale e della riduzione dei fallimenti reiterati di impianto. Pertanto, si consiglia di sviluppare tale caratterizzazione e-unitamente- avviare trials clinici protesi a correlare con solide casistiche e disegni di studio strutturati per profili di popolazione con stati patologici veri e propri. Nonché studiare trattamenti protesi a modificare le patologie riscontrabili con probiotici o altro, nella finalità di ottenere dimostrazioni solide di utilità di queste conoscenze. Che ancora non esistono.

Conclusioni

Riaffermiamo che l’antico concetto di endometrio sterile, e del compartimento uterino in generale, è superato, sebbene il vero microbioma uterino centrale debba ancora essere valutato nella sua interezza. Sono necessari studi funzionali per chiarire l’importanza fisiologica del microbioma nella fertilità. La sfida dello studio dell’immunologia riproduttiva e del microbiota coinvolto è che la ricerca su tutti i diversi aspetti è ancora agli inizi; microbioma, immunità, endocrinologia in gravidanza e sviluppo placentare e fetale devono essere studiati insieme per ottenere una panoramica più completa.

L’endometrio umano ha un microbiota che è indipendente dalla regolazione ormonale. L’esistenza di batteri non Lactobacillus nell’endometrio sarebbero (un solo studio di evidenza) correlati con un impatto negativo sulla funzione riproduttiva e dovrebbe essere attenzionato secondo alcuni autori come una causa di fallimento di impianto e di aborto spontaneo. L’impiego tuttavia degli antibiotici preliminarmente non migliora l’outcome riproduttivo né migliorando l’impianto né riducendo gli aborti spontanei. Alcuni autori dei lavori qui presentati ritengono sia utile ampliare la valutazione della ricettività endometriale non solo a livello morfologico e livelli molecolari ma anche dal punto di vista microbiologico. Ma questa affermazione non è sufficientemente suffragata da evidenze per chi scrive. È certamente ora di considerare i microrganismi non solo come nemici ma anche come potenziali alleati nella riproduzione ancorché – per ora – al solo fine di disegnare studi di efficacia senza conclusioni premature.

Abbiamo rilevato solo due studi strutturati per evidenza clinica, il primo di Velasco et al che si inserisce come opinione di un panel di esperti enfatizzando l’importanza del microbiota nell’impianto con molti studi osservazionali riportati ma pochissime evidenze (Evidenza di grado 4) e quello del gruppo di Carlos Simon che, tuttavia, studiando un numero troppo esiguo di donne riporta l’importanza del microbiota sano come generatore di una percentuale di impianti embrionali maggiori rispetto a quello patologico. Qui definiti sulla base della dominanza o meno dei lattobacilli. Allo stato attuale delle conoscenze e degli studi appare a chi scrive inappropriato l’impiego clinico della determinazione della popolazione cellulare immunocompetente e microbiale endometriale nella pratica clinica dei trattamenti di infertilità, specificamente nei fallimenti di impianto fino a nuove più solide evidenze. Ancora di più appare a chi scrive legittimo e auspicabile ogni studio finalizzato a chiarire quanto sopra esposto – in particolare con studi portatori di evidenze di grado I-III – ma appare al tempo stesso assolutamente da disincentivare la deprecabile condotta deontologica di inserire test di definizione del microbiota endometriale senza queste evidenze nel percorso di coppie che si sottopongono a programmi di fecondazione in vitro laddove se ne imputino oneri finanziari alle stesse coppie.